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          *的液相色譜柱知識(shí)分享和選擇技巧分享

          更新時(shí)間:2021-05-19      點(diǎn)擊次數(shù):2513
            

           
            
           現(xiàn)代高效液相色譜分析中,色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞,選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發(fā)所需的時(shí)間,并且使方法更具穩(wěn)定性。但是現(xiàn)在市場(chǎng)上色譜柱種類繁多,不同類型的色譜柱分離對(duì)象不同,因此,要做合適的選擇,必須對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解。

           
            
            色譜柱參數(shù)

           
            
            物理性質(zhì):

           
            
            柱長,內(nèi)徑,如250*4.6mm。一般柱長在2—250mm,柱越長,分離度越高,但柱壓更高,分離所需時(shí)間更長;但分離度與理論塔板數(shù)的平方根成正比,所以一昧增加柱長并不是*的分離手段,一般情況下,150mm、5um的填料可以提供足夠的塔板數(shù)。

           
            
            粒徑,影響色譜分離度。粒徑越小,分離越快,柱效越高,但柱壓力越高,柱容易被污染,導(dǎo)致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料,復(fù)雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑,更大內(nèi)徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍,因此如何選擇填料粒徑需要根據(jù)現(xiàn)實(shí)情況而定。本文來源于國內(nèi)的第三方檢測(cè)平臺(tái)嘉峪檢測(cè)網(wǎng),提供檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、技術(shù)培訓(xùn)、儀器計(jì)量校準(zhǔn)服務(wù)。

           
            
            孔徑,60A,120A,300A等??讖叫?,則含孔率高,比表面積大,載碳量高;色譜柱填料孔徑大小需和分子大小相匹配,保證分子自由進(jìn)出填料孔并與孔內(nèi)表面的鍵合相進(jìn)行分離分配,通常要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上,一般小分子使用80—120A,大分子使用300A。

           
            
            顆粒形狀,一般有球形和不規(guī)則形,當(dāng)使用黏度較大的流動(dòng)相時(shí),球形顆粒可以降低柱壓,延長色譜柱壽命。

           
            
            比表面積,指的是每克填料的表面積,如180m2/g—350m2/g,與粒度和含孔率有關(guān);比表面積大,會(huì)增加樣品與鍵合相之間的反應(yīng),增加保留和分離度;比表面積小則可以縮短分析時(shí)間和平衡時(shí)間,并不是比表面積大或者小就更好,需要選擇合適的比表面積。

           
            
            化學(xué)性質(zhì):

           
            
            硅膠基質(zhì):通用的基質(zhì),強(qiáng)度大,化學(xué)修飾容易,但使用的pH值范圍有限(一般為2—8,特殊修飾的可以達(dá)到1—12)。

           
            
            聚合物基質(zhì):多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂,化學(xué)穩(wěn)定,應(yīng)用pH范圍寬,具有更強(qiáng)的疏水性,對(duì)蛋白質(zhì)等樣品分離效果較好;但強(qiáng)度較小,有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物溶脹而受損,批次重復(fù)性較差,商品化色譜柱不多,一般價(jià)格較貴。

           
            
            載碳量:基質(zhì)表面鍵合相的比例,載碳量高,則保留增加,適合分析非極性化合物。

           
            
            鍵合相:鍵合試劑不同,對(duì)化合物的選擇性不同,一般長鏈的烷基鍵合相(C18C8)比短鏈的(C4C3)穩(wěn)定;非極性的鍵合相比極性的鍵合相(-NH2)穩(wěn)定。

           
            
            封端:用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來,以減少殘留的硅醇基,減輕待測(cè)組分與酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象。尤其對(duì)于極性樣品而言,未封端處理的色譜柱分離效果較差。 

           
            

           
            

           
            

           
            

           


           
            

           


           
            

           
            

           

           

          固定相極性

           

          流動(dòng)相極性

           

          出峰順序

           

          反相吸附色譜

           

          非極性

           

          強(qiáng)極性(水、甲醇、乙腈等)

           

          強(qiáng)極性物質(zhì)先出峰

           

          正相吸附色譜

           

          極性

           

          弱極性(己烷、庚烷等)

           

          弱極性物質(zhì)先出峰

           

           
            柱長及內(nèi)徑的選擇:
           
           
            長度的選擇:柱越長,總柱效越高(n值越大),柱越長,分析時(shí)間也越長。250—300mm是普遍的柱長,實(shí)驗(yàn)室一半以上的工作都是采用此規(guī)格柱子,一般用來分離l0到50個(gè)組份的中等至復(fù)雜混合物;500—600mm,要求較高分辨率的應(yīng)用,—般用來分離大于50個(gè)組份或包含有難分離物質(zhì)的復(fù)雜樣品程序升溫分析。
           
           
            內(nèi)徑:柱效率與柱半徑平方成反比,內(nèi)徑越小柱效越高,但內(nèi)徑越大,柱容量也增加,允許進(jìn)樣量就越多。當(dāng)進(jìn)樣量超過柱容量時(shí),則因柱內(nèi)每塊理論板內(nèi)不能建立真正的平衡,將會(huì)導(dǎo)致色譜蜂畸變,柱分辨率降低,重現(xiàn)性不好。因此對(duì)于復(fù)雜樣品需要精確分離,必須使用小內(nèi)徑柱子。另一方面若樣品中存在具有很不相同濃度組份化合物,為了增加樣品容量就必須使用內(nèi)徑大的柱子,目前實(shí)驗(yàn)室使用最常見的柱子內(nèi)徑一般是4.6mm。
           
           
            一般選擇原則:分析大分子量化合物選擇大孔徑色譜柱;對(duì)于高pH值或者堿性化合物需要選擇高封端或者特殊封端的色譜柱,以改善峰形,延長色譜柱使用壽命等。
           
            現(xiàn)在商品化的液相色譜柱琳瑯滿目,根據(jù)色譜柱的參數(shù)可以給我們提供一個(gè)初步的選擇,但由于各個(gè)儀器廠商的填料技術(shù)和鍵合技術(shù)都有差異,即使都是C18柱,同一品牌不同系列都有不同的功能,有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。所以在選擇色譜柱前要好好研究色譜柱參數(shù),仔細(xì)閱讀色譜柱說明書,才能找到合適的色譜柱和適宜的分離方法。
          正相&反相色譜
            目前市場(chǎng)上主要以反相色譜為主,約占80%的比例。

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