1.流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣，清除微粒和灰塵。在送液泵內，為了防止雜物（固體）進入流路，裝有吸濾器，但網孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過，這會導致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時，或壓力溫度變化時容易產生大量氣泡，會導致泵誤動作和輸液不暢，檢測器產生噪聲信號等。
2.流動相恢復到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復到室溫前，基線水平很難穩定，特別是發生漂移，也容易產生氣泡等現象。水與有機溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務必注意。
3.做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水，水相流動相需經常更換，防止長菌變質。使用去離子水、針劑水、純凈水（炊用）并不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結果。
4.流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的
5.用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用后都要用水清洗流路，絕對禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。
6.若需要使用含鹽的流動相，使用前請過濾。并且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機相（有機相含量應不低于10%）的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現用現配，以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
7.進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性，避免因流動相不互溶而導致的緩沖鹽析出問題。反相系統更換正相系統或正相系統更換反相系統時，用異丙醇置換系統內的儲存流動相后在接柱子。
8.在更換兩種互不相溶的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然后在用正己烷做流動相時，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。
9.儀器在短期（兩三天）不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應用甲醇。
10.對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。
11.當流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現異常。這是由于乙氰的粘性大，導致泵的流速降低。可適當提高流速使泵的壓力恢復正常即可。
12.流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯，乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時，分析完了后，應立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
13.用于檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。
14.注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。
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